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• 背景
• 体外合成并测定
• 基于测序得到的特征构建预测器
• 预测体内的m6A修饰
• 代码
• 参考

背景

• m6A修饰具有非常重要的功能
• 目前主要依赖于m6A-seq进行测定：受限于抗体，只有部分种类的修饰类型被测定到
• 使用三代测序，利用读段通过纳米孔产生的电流变化进行鉴定
• 电流变化需要比较电势图谱且重新map
• 开发基于三代测序数据进行m6A位点鉴定的方法

体外合成并测定

图解：首先是做了体外合成的实验

• a）体外合成的实验示意图。对于5bp长度的所有序列，每个碱基4个可能性，4^5=2^10=1024。对于合成的序列，分别测定有m6A修饰和没有修饰的序列，及此时电势（current）的大小。获得了对应条件下的特征：电势、碱基质量、错配频率、碱基删除和插入等，然后把这些特征进行机器学期模型的训练（这里是SVM）。
  • 为什么选择5bp？m6A常规的motif序列是RRACH是5bp的。
  • 做法：使用curlcake软件预测生成了1条10kb长的序列（包含了所有可能的1024个5mer，平均每个5mer出现10次），这里还考虑了预测的二级结构，使得二级结构最小。然后切成了四段，每段2000+长度，然后合成了这四条序列。
• b）其中一条合成序列的例子。在两个组中的track图，可以看到，在m6A修饰的组中，很多地方出现了突变（但是突变方向即突变后的碱基不固定），在对照组(相同序列但是没有m6A修饰的)就没有出现突变。
• c）在m6A组和对照组比较不同的指标的分布。具有区分性，且符合m6A修饰带来的测序质量更低、突变频率更高。
• d-g）不同指标在重复之间的相关性。这里没有列举出insertion，是因为这个指标在不同的rep之间重复性不好，因而不好作为m6A修饰预测时的特征。

基于测序得到的特征构建预测器

图解：

• a）每个碱基位置的特征分布，5bp x 3特征。上面图1是展示的所有可能的5mer的分布，这里展示的是m6A motif 5mer的分布，也是符合的，且每个碱基位点都是符合的。
• b-c）根据motif的feature是否可以区分m6A修饰的和没有修饰的？比如图b，有两套数据，一套是来源于含有m6A的合成序列，一个是来源于不含有m6A序列，但是都挑出具有m6A motif（RRACH）的5mer。现在根据3x5=15个特征进行PCA聚类，分成两类，发现分成的两类和他们的来源对应的很好，说明这些特征是具有很好的m6A区分性的（相同序列，但是特征不同，就可以判断m6A的修饰存在与否）。同理，挑出其他的非m6Amotif 5mer，做PCA，此时分不开，说明这些特征是特异的区分m6A的，而不是任何的都能区分开的。
• d）每个特征单独训练，是否能很好的预测m6A修饰？
  • 70-86%的准确性。
  • current的两个特征效果最差：43-65%准确性
  • 训练集正样本：属于RRACH的5mer且来源于m6A合成序列，负样本：属于RRACH的5mer且来源于没有m6A修饰的合成序列。
  • 这里为什么每个是两条线？两次的结果？那差异有点大啊
• e）使用不同的特征组合看效果，整体效果都好很多：88-91%准确性
• f）邻近的碱基特征使用进来，能提高预测的准确性：97-99%，但此时的假阳性也增高了，因此不应该使用其邻近位点的特征
• g）一定比例的修饰read和非修饰read混合，模型效果还行，即使25%的甲基化比例，能达到0.72的AUC。使用combined feature model预测。

预测体内的m6A修饰

图解：这个图index和legend没有对应上。

• a）测定yeast数据。WT vs ime4 KO，后者就不能进行m6A修饰，相当于前面的control测定。分别测定，得到两个条件下的碱基特征值。
• b）read count在基因水平的重复之间相似性，同时把ime4的表达量label出来了。
• c）先看在以前鉴定的m6A位点上的特征分布。这里比较的是错配频率，可以看到，KO组比WT组低，KO组和之前invitro CC0%很接近，但是这里的WT组比100%CC也低了1倍。
• d）这是比较在以前鉴定的m6A位点上的几个特征在不同重复之间的分布，重复性很好，且符合修饰位点碱基质量更低、突变频率更高的特性。
• e）这里通过线性估计，在WT时，大概12-30%的m6A修饰，这个和之前的一个工作做得估计很接近。
• f）这是show的例子，但是有点懵！取了三个位点（之前其他工作已经鉴定过的），是在WT里面有明显突变的，但是ime4 KO没有。其他位点颜色呢？这样看：对于没有突变的位点，其整个bar是灰色的；如果有至少1个突变，则bar会显示各个碱基的比例。所有比如最右侧A，整个bar看起来是绿色的A，说明大部分是没有突变的，但是是存在其他突变碱基的。
• g）在WT和ime4 KO共有的RRACH位点是61163个，其中已知是m6A的有363个，未知的是609=794个。通过invitro得到的模型，预测这里invivo WT和ime4 KO数据里面m6A位点的score，然后看分布。
  • WT known vs unknown：相同细胞系，已知和未知的，已知的预测得到分数更高，说明预测的很好
  • ime4 KO known vs unknown：相同细胞系，已知和未知的，已知的预测得到分数接近，本身这些应该就是很接近的（都是没有m6A修饰的），说明预测的很好
  • WT unknown vs ime4 KO unknown：有差异，说明存在潜在的新的m6A位点？ h）在invivo数据达到0.68 AUC。

代码

相关的代码已经放在 EpiNano@github 上面了，可以参考。

参考

• Talk @London Calling 2019
• Eva Maria Novoa - Accurate detection of m6A RNA modifications in native RNA sequences using third-generation sequencing
• Accurate detection of m6A RNA modifications in native RNA sequences