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高通量测序与高性能计算-1-测序技术发展

Tag: reading, genomics
2018-05-13

  1. 人类基因组计划（HGP）启动于1990年，6个国家（美国，英国，日本，法国，德国和中国【唯一发展中国家】）的16个研究中心参与，整体计划于2003年完成（中国负责的1%是2001年提前两年完成）。与曼哈顿原子弹计划、阿波罗登月计划称为自然科技史上的“三大计划”。
  2. HGP的完成主要基于Sanger测序方法。
  3. 发展中的DNA测序技术：
    • 自动测序仪
    • 毛细管凝胶电泳测序技术
    • 杂交测序技术
    • 基因芯片测序技术
    • PCR直接测序技术
    • cDNA微阵列技术
  4. 一代测序（经典测序方法）：
    • 化学降解法：Maxam & Gilbert （1977）：随机打断DNA得到片段，在片段的5’端磷酸基团进行放射性标记，然后用不同的化学试剂进行修饰以裂解特定碱基（不同修饰断裂不同碱基），这样得到了一系列长度不同但是5‘起始相同且被标记的DNA片段（共同起点，不同终点），从而知道每个片段所停位置的碱基，不同的片段按照5’-3‘的顺序拼接起来就是所测序列。
    • 双脱氧核苷酸末端中止法：Sanger （1977）：先随机打断，然后分四管平行反应，每一个管中的ddNTP不同，其他反应物相同，这样特定的ddNTP掺入合成的DNA后，反应终止，形成对应的ddNTP信号的片段（末端碱基为该管中的ddNTP），然后电泳就知道了（四个泳道分别是不同的ddNTP）。
  5. 影响DNA测序的因素：
    • 样本浓度：浓度过高时，起始荧光强度大，拖尾现象严重，荧光标记物很快消耗完，读序短、误差大、可信度低；浓度过低时：荧光信号强度和背景在相当水平，完全区分不开，测序信号不靠谱；
    • 样品浓度的鉴定：分光光度法（对PCR产物，需电泳确定条带的特异性：清晰、无杂带、不拖尾）；DNA定量仪：A（260/280）~[1.8，2。0], <1.8: 蛋白高, >2.0: RNA高；
    • 样品纯度：不纯时信号杂乱不能读取，即使读取出来也只是分析软件的放大作用，错误率很高。其他物质浓度过高、盐浓度过高、TE缓冲液等。
  6. 二代测序：
    • 罗氏454（2005， Genome Sequencer 20 system）：(1)文库制备；（2）Emulsion PCR：磁珠结合DNA扩增；（3）测序反应：配对释放焦磷酸，生成ATP驱动释放荧光信号；（4）数据分析。
    • Illumina Solexa：（1）文库制备；（2）产生DNA簇：固定于芯片上进行桥式扩增；（3）测序：边合成边测序，荧光标记dNTP的，掺入碱基，记录信号，切除“终止子”基团，以进行下一轮掺入；
    • ABI SOLiD：利用DNA连接酶在连接过程中读取序列。
  7. 二代测序的应用：
    • 新物种的de novo测序及基因组重测序
    • 目标序列捕获技术：较PCR更简单高效；可确定遗传变异
    • 环境基因组学研究：主要是微生物
    • 表达谱和转录组分析：RNAseq，不用传统的杂交探针；表达量及时间序列的动态变化
    • 小RNA研究：读长短、通量高，鉴定新的小RNA
    • 表观基因组学研究
  8. 测序平台的比较：seq_platform_comparison.png
  9. 三代测序技术：
  • Heliscope单分子测序：边合成边测序
  • PacBio SMRT（单分子实时测序）：芯片含有很多ZMW孔道(DNA聚合酶+片段+荧光标记的dNTP)，当合成时，产生对应的磷酸基团的荧光，从而读出信号。
  • 纳米孔单分子技术：核酸外切酶切割ssDNA，单个碱基落入纳米孔，与孔内的分子环糊精作用，短暂改变电流强度，从而表征碱基信号。

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